يحتوي سم الأفعى على إنزيمات تعمل على تحلل روابط إستر الكربوكسيل.ركائز التحلل المائي هي الفوسفوليبيدات والأسيتيل كولين والأسيتات العطرية.تشمل هذه الإنزيمات ثلاثة أنواع: فسفوليباز ، أسيتيل كولينستراز وإستريز عطري.يمكن أن يحلل استراز الأرجينين الموجود في سم الأفعى أيضًا الأرجينين الاصطناعي أو اللايسين ، ولكنه يحلل بشكل أساسي روابط الببتيد البروتيني في الطبيعة ، لذلك فهو ينتمي إلى البروتياز.إن الإنزيمات التي تمت مناقشتها هنا تعمل فقط على ركائز الإستر ولا يمكنها العمل على أي رابطة ببتيدية.من بين هذه الإنزيمات ، تعد الوظائف البيولوجية لأسيتيل كولينستراز وفوسفوليباز أكثر أهمية وتم دراستها بشكل كامل.بعض سموم الثعابين لها نشاط استريز عطري قوي ، والذي يمكن أن يتحلل مائي p-nitrophenyl ethyl ester ، a - أو P-naphthalene acetate و indole ethyl ester.لا يزال من غير المعروف ما إذا كان هذا النشاط ناتجًا عن إنزيم مستقل أو أحد الآثار الجانبية المعروفة للكربوكسيل استيراز ، ناهيك عن أهميته البيولوجية.عندما تم تفاعل سم Agkistrodon halys Japonicus مع p-nitrophenyl ethyl ester و indole ethyl ester ، لم يتم العثور على التحلل المائي لـ p-nitrophenol و indole phenol ؛على العكس من ذلك ، إذا تفاعلت هذه الإسترات مع نوع فرعي من الكوبرا تشوشان وسم الأفعى وسم الأفعى Bungarus multicinctus ، فسيتم تحللها بسرعة.من المعروف أن سموم الكوبرا هذه لها نشاط قوي لأنزيم الكولينستريز ، والذي قد يكون مسؤولاً عن التحلل المائي للركائز المذكورة أعلاه.في الواقع ، ماكلين وآخرون.(1971) أن العديد من سموم الثعابين التي تنتمي إلى عائلة الكوبرا يمكن أن تتحلل بالماء الإندول إيثيل استر ونفثالين إيثيل إستر وبوتيل النفثالين إستر.سموم الثعابين هذه تأتي من: الكوبرا ، الكوبرا السوداء العنق ، الكوبرا السوداء الشفافة ، الكوبرا الذهبية ، الكوبرا المصرية ، الكوبرا الملك ، الكوبرا الذهبية مامبا ، المامبا السوداء والمامبا ذات الشفاه البيضاء (لا يزال D. aw يعرف أفعى rhombola الشرقية.
يمكن لسم الثعبان أن يتحلل ميثيل إندول إيثيل استر ، وهو الركيزة لتحديد نشاط الكولينستريز في مصل الدم ، لكن سم الأفعى هذا لا يظهر نشاط الكولينستريز.هذا يدل على وجود إستراز غير معروف في سم الكوبرا ، والذي يختلف عن الكولينستريز.لفهم طبيعة هذا الإنزيم ، هناك حاجة إلى مزيد من أعمال الفصل.
1 ، فوسفوليباز A2
(I) نظرة عامة
فسفوليباز إنزيم يمكنه تحلل فوسفات الجليسريل.هناك 5 أنواع من الفوسفوليباز في الطبيعة ، وهي فسفوليباز A2 و فسفوليباز
A. ، phospholipase B ، phospholipase C و phospholipase D. يحتوي سم الأفعى بشكل أساسي على phospholipase A2 (PLA2) ، وتحتوي بعض سموم الثعابين على phospholipase B ، وتوجد بشكل أساسي في أنسجة الحيوانات والبكتيريا.يوضح الشكل 3-11-4 موقع عمل هذه الفسفوليباسات على التحلل المائي للركيزة.
تمت دراسة PLA2 أكثر من بين الفسفوليباسات.قد يكون الإنزيم الأكثر دراسة في سم الأفعى.الركيزة الخاصة به هي رابطة الإستر في الموضع الثاني من Sn-3-glycerophosphate.يوجد هذا الإنزيم على نطاق واسع في سم الثعابين ، وسم النحل ، وسم العقرب والأنسجة الحيوانية ، و PLA2 متوفر بكثرة في أربع سموم أفعى عائلية.لأن هذا الإنزيم يكسر خلايا الدم الحمراء ويسبب انحلال الدم ، ويسمى أيضًا "الهيموليزين".يسمي بعض الناس أيضًا الليسيثيناز الانحلالي PLA2.
وجد Ludeeke لأول مرة أن سم الأفعى يمكن أن ينتج مركبًا انحلاليًا عن طريق العمل على الليسيثين من خلال الإنزيمات.في وقت لاحق ، Delezenne et al.أثبت أنه عندما يؤثر سم الكوبرا على مصل أو صفار الحصان ، فإنه يشكل مادة انحلالية.من المعروف الآن أن PLA2 يمكن أن يعمل بشكل مباشر على الدهون الفوسفورية في غشاء كرات الدم الحمراء ، مما يؤدي إلى تدمير بنية غشاء كرات الدم الحمراء والتسبب في انحلال الدم المباشر ؛يمكن أن يعمل أيضًا على مصل الدم أو الليسيثين المضاف لإنتاج الليسيثين الانحلالي ، والذي يعمل على خلايا الدم الحمراء لإنتاج انحلال الدم غير المباشر.على الرغم من وفرة PLA2 في العائلات الأربع لسم الثعابين ، إلا أن محتوى الإنزيمات في سموم الثعابين المختلفة يختلف قليلاً.أفعى الجرسية (C.
أظهر سم الأفعى فقط نشاط PLA2 ضعيف.يوضح الجدول 3-11-11 مقارنة نشاط PLA2 لعشر سموم رئيسية من الثعابين السامة في الصين.
جدول 3-11-11 مقارنة بين أنشطة فسفوليباز VIII لعشرة سم أفعى في الصين
سم الثعبان
إطلاق الدهون
حمض الأليفاتيك ،
Cjumol / ملغ)
النشاط الانحلالي CHU50 / ^ g * ml)
سم الثعبان
إطلاق الأحماض الدهنية
(^ راول / ملغ)
نشاط انحلال الدم "(HU50 / قدم * 1111)
نجناجا أترا
9. 62
أحد عشر
Micracephal ophis
خمسة فاصل واحد صفر
كالس بالاس
8.68
ألفان وثمانمائة
جراسيليس
الخامس ، الخطي
7. 56
* * #
حنة المريء
ثلاثة فاصل ثمانية اثنان
مئة وأربعون
Bnugarus fasctatus
7،56
مائتان وثمانون
B. multicinctus
تسعة ستة ستة
مائتان وثمانون
أفعى روسيللي
سبعة فاصلة صفر ثلاثة
T ، mucrosquamatus
ثمانية خمسة خمسة
سيامينسيس
T. ستيجنيجيري
0. 97
2 الفصل والتنقية
محتوى PLA2 في سم الأفعى كبير ، ومستقر للتسخين ، والحمض ، والقلويات ، ومحول الطبيعة ، لذلك من السهل تنقية PLA2 وفصله.تتمثل الطريقة الشائعة في إجراء ترشيح الهلام أولاً على السم الخام ، ثم إجراء كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، ويمكن تكرار الخطوة التالية.وتجدر الإشارة إلى أن التجميد والتجفيف لـ PLA2 بعد كروماتوغرافيا التبادل الأيوني يجب ألا يتسبب في التراكم ، لأن عملية التجفيف بالتجميد غالبًا ما تزيد من القوة الأيونية في النظام ، وهو عامل مهم يسبب تراكم PLA2.بالإضافة إلى الطرق العامة المذكورة أعلاه ، تم أيضًا اعتماد الطرق التالية: ① Wells et al.② تم استخدام التناظرية الركيزة لـ PLA2 كروابط لكروماتوغرافيا التقارب.يمكن أن يرتبط هذا الترابط بـ PLA2 في سم الأفعى مع Ca2 +.يستخدم EDTA في الغالب كعنصر eluent.بعد إزالة Ca2 + ، يقل التقارب بين PLA2 والرابط ، ويمكن فصله عن الترابط.يستخدم البعض الآخر محلولًا عضويًا بنسبة 30٪ أو 6 مل / لتر من اليوريا على شكل شطف.③ تم إجراء كروماتوغرافيا كارهة للماء باستخدام PheiiylSephar0SeCL-4B لإزالة أثر PLA2 في سم القلب.④ تم استخدام الجسم المضاد لـ PLA2 كلجند لإجراء تحليل كروماتوجرافي تقارب على PLA2.
حتى الآن ، تم تنقية عدد كبير من سم الثعابين PLAZ.تو وآخرون.(1977) أدرج PLA2 المنقى من سم الأفعى قبل عام 1975. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن عدد كبير من المقالات حول فصل وتنقية PLA2 كل عام.هنا ، نركز على فصل وتنقية جيش التحرير الشعبى الصينى من قبل العلماء الصينيين.
Chen Yuancong et al.(1981) فصل ثلاثة أنواع من PLA2 عن سم Agkistrodon halys Pallas في تشجيانغ ، والذي يمكن تقسيمه إلى PLA2 الحمضي والمحايد والقلوي وفقًا لنقاطها الكهربية المتساوية.وفقًا لسميته ، يعد PLA2 المحايد أكثر سمية ، والذي تم تحديده على أنه سم عصبي قبل المشبك Agkistrodotoxin.القلوية PLA2 أقل سمية ، و PLA2 الحمضي ليس له سمية تقريبًا.وو شيانغفو وآخرون.(1984) مقارنة خصائص ثلاثة PLA2s ، بما في ذلك الوزن الجزيئي ، وتكوين الأحماض الأمينية ، والنقطة الطرفية ، والنقطة الكهروضوئية ، والاستقرار الحراري ، ونشاط الإنزيم ، والسمية ، والنشاط الانحلالي.أظهرت النتائج أن لديهم نفس الوزن الجزيئي والاستقرار الحراري ، ولكن لديهم اختلافات كبيرة في الجوانب الأخرى.فيما يتعلق بنشاط الإنزيم ، كان نشاط الإنزيم الحمضي أعلى من نشاط الإنزيم القلوي.كان التأثير الانحلالي للإنزيم القلوي على خلايا الدم الحمراء في الجرذان هو الأقوى ، يليه إنزيم محايد ، ثم إنزيم حامضي بالكاد يتحلل.لذلك ، يُفترض أن التأثير الانحلالي للبلاز مرتبط بشحنة جزيء PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) صنعت بلورات Agkistrodotoxin.تو غوانغليانغ وآخرون.(1983) ذكر أن PLA السام مع نقطة تساوي كهربية تساوي 7. 6 تم عزله وتنقيته من سم Vipera rotundus من Fujian ، وخواصه الفيزيائية والكيميائية ، وتكوين الأحماض الأمينية وتسلسل 22 من بقايا الأحماض الأمينية في N تم تحديد النهايات.Li Yuesheng et al.(1985) عزل وتنقية PLA2 آخر من سم Viper rotundus في فوجيان.الوحدة الفرعية لـ PLA2 * هي 13800 ، والنقطة الكهربية 10.4 ، والنشاط المحدد هو 35 / xnioI / miri mg مع الليسيثين كركيزة ، يكون الرقم الهيدروجيني الأمثل للإنزيم 8.0 ودرجة الحرارة المثلى 65 درجة مئوية حقن LD5 عن طريق الوريد في الفئران.إنه 0.5 ± 0.12 مجم / كجم.هذا الإنزيم له تأثيرات واضحة مضادة للتجلط وانحلالي.يتكون جزيء PLA2 السام من 123 بقايا من 18 نوعًا من الأحماض الأمينية.الجزيء غني بالسيستين (14) وحمض الأسبارتيك (14) والجليسين (12) ، ولكنه يحتوي فقط على ميثيونين واحد ، والطرف N الخاص به عبارة عن بقايا سيرين.مقارنةً بـ PLA2 المعزول بواسطة Tuguang ، فإن الوزن الجزيئي وعدد بقايا الأحماض الأمينية لنزيمي الإنزيمات متشابهان جدًا ، كما أن تركيبة الأحماض الأمينية متشابهة جدًا ، لكن عدد حمض الأسبارتيك وبقايا البرولين مختلف إلى حد ما.سم ثعبان الكوبرا ملك جوانجشي يحتوي على PLA2 الغني.شو يويان وآخرون.(1989) عزل PLA2 من السم ، والذي له نشاط محدد 3.6 مرة أعلى من السم الأصلي ، ووزن جزيئي 13000 ، وتركيب 122 من بقايا الأحماض الأمينية ، ونقطة تساوي الكهرباء 8.9 ، وثبات حراري جيد.من خلال مراقبة المجهر الإلكتروني لتأثير PLA2 الأساسي على خلايا الدم الحمراء ، يمكن ملاحظة أن له تأثيرًا واضحًا على غشاء خلايا الدم الحمراء البشرية ، ولكن ليس له تأثير واضح على خلايا الدم الحمراء في الماعز.هذا PLA2 له تأثير تخلف واضح على السرعة الكهربي لخلايا الدم الحمراء في البشر والماعز والأرانب وخنازير غينيا.Chen et al.يمكن لهذا الإنزيم أن يمنع تراكم الصفائح الدموية الناجم عن ADP والكولاجين وحمض أراكيدونيك الصوديوم.عندما يكون تركيز PLA2 10 / xg / ml ~ lOOjug / ml ، يتم تثبيط تراكم الصفائح الدموية تمامًا.إذا تم استخدام الصفائح الدموية المغسولة كمواد ، فلن يتمكن PLA2 من تثبيط التجميع بتركيز 20 مجم / مل.الأسبرين هو مثبط لانزيمات الأكسدة الحلقية ، والتي يمكن أن تمنع تأثير PLA2 على الصفائح الدموية.قد يمنع PLA2 تراكم الصفائح الدموية عن طريق التحلل المائي لحمض الأراكيدونيك لتخليق الثرموبوكسان A2.تمت دراسة شكل المحلول لـ PLA2 الناتج عن سم Agkistrodon halys Pallas في مقاطعة تشجيانغ عن طريق ازدواج اللون الدائري والفلورة وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية.أظهرت النتائج التجريبية أن الشكل الرئيسي للسلسلة لهذا الإنزيم كان مشابهًا لنفس النوع من الإنزيم من الأنواع والأجناس الأخرى ، وكان لتشكيل الهيكل العظمي مقاومة جيدة للحرارة ، وكان التغيير الهيكلي في البيئة الحمضية قابلًا للعكس.لا يؤثر الجمع بين المنشط Ca2 + والإنزيم على بيئة مخلفات التربتوفان ، بينما يقوم المانع Zn2 + بالعكس.تختلف الطريقة التي تؤثر بها قيمة الرقم الهيدروجيني للمحلول على نشاط الإنزيم عن الكواشف المذكورة أعلاه.
في عملية تنقية سم الأفعى PLA2 ، هناك ظاهرة واضحة وهي أن سم الأفعى يحتوي على اثنين أو أكثر من قمتي شطف PLA2.يمكن تفسير هذه الظاهرة على النحو التالي: ① بسبب وجود الانزيمات.② تتم بلمرة نوع واحد من PLA2 في مجموعة متنوعة من خلائط PLA2 بأوزان جزيئية مختلفة ، معظمها في حدود 9000 ~ 40000 ؛③ إن الجمع بين PLA2 ومكونات سم الأفعى الأخرى يعقد PLA2 ؛④ لأن رابطة الأميد في PLA2 تتحلل بالماء ، تتغير الشحنة.① و شائعان ، مع استثناءات قليلة فقط ، مثل PLA2 في سم الثعبان CrWa / w
هناك حالتان: ① و ②.تم العثور على الشرط الثالث في PLA2 في سم الثعابين التالية: Oxyranus scutellatus و Parademansia microlepidota و Bothrops a ^> er والأفعى الفلسطينية والأفعى الرملية والأفعى الجرسية الرهيبة km。
نتيجة الحالة ④ تجعل سرعة انتقال PLA2 تتغير أثناء الرحلان الكهربائي ، لكن تكوين الأحماض الأمينية لا يتغير.يمكن تكسير الببتيدات عن طريق التحلل المائي ، لكنها بشكل عام لا تزال مرتبطة ببعضها البعض بواسطة روابط ثاني كبريتيد.يحتوي سم أفعى الحفرة الشرقية على شكلين من PLA2 ، يسميان النوع a والنوع p PLA2 على التوالي.الفرق بين هذين النوعين من PLA2 هو حمض أميني واحد فقط ، أي أن الجلوتامين في جزيء PLA2 واحد يتم استبداله بحمض الجلوتاميك في جزيء PLA2 الآخر.على الرغم من أن السبب الدقيق لهذا الاختلاف غير واضح ، إلا أنه يُعتقد عمومًا أنه مرتبط بنزع أمين PLA2.إذا تم الحفاظ على PLA2 في سم الأفعى الفلسطينية دافئًا مع السم الخام ، فإن المجموعات الطرفية في جزيئات الإنزيم ستصبح أكثر من ذي قبل.من C PLA2 المعزول من سم الأفعى له طرفان مختلفان من N ، ويبلغ وزنه الجزيئي 30000. قد تكون هذه الظاهرة ناتجة عن ثنائي مائي غير متماثل لـ PLA2 ، والذي يشبه الثنائى المتماثل الذي يتكون من PLA2 في سم أفعى الجرسية الشرقية. والأفعى الجرسية الغربية.تتكون الكوبرا الآسيوية من العديد من الأنواع الفرعية ، بعضها ليس محددًا جدًا في التصنيف.على سبيل المثال ، تم التعرف الآن على ما كان يطلق عليه السلالات الفرعية Cobra Outer Caspian
يجب أن تنسب إلى الكوبرا في بحر قزوين الخارجي.نظرًا لوجود العديد من الأنواع الفرعية ويتم خلطها معًا ، فإن تكوين سم الأفعى يختلف اختلافًا كبيرًا بسبب المصادر المختلفة ، كما أن محتوى إنزيمات PLA2 مرتفع أيضًا.على سبيل المثال ، سم الكوبرا
تم العثور على ما لا يقل عن 9 أنواع من إنزيمات PLA2 لأنواع r ^ ll ، و 7 أنواع من isozymes PLA2 تم العثور عليها في سم سلالات الكوبرا الفرعية Caspian.دوركين وآخرون.(1981) درس محتوى PLA2 وعدد الإنزيمات في سموم الأفعى المختلفة ، بما في ذلك 18 سم كوبرا ، 3 سم مامبا ، 5 سم أفعى ، 16 سم أفعى جرسية و 3 سم أفعى بحرية.بشكل عام ، يكون نشاط PLA2 لسم الكوبرا مرتفعًا ، مع وجود العديد من الإنزيمات.إن نشاط PLA2 وإنزيمات سم الأفعى متوسطة.نشاط PLA2 لسم مامبا وسم الأفعى الجلجلة منخفض جدًا أو لا يوجد نشاط PLA2.كما أن نشاط PLA2 لسم ثعبان البحر منخفض أيضًا.
في السنوات الأخيرة ، لم يتم الإبلاغ عن وجود PLA2 في سم الأفعى في شكل ثنائيات نشطة ، مثل أفعى الجرسية الشرقية المعينية (يحتوي سم الأفعى على النوع أ والنوع P PLA2 ، وكلاهما يتكون من وحدتين فرعيتين متطابقتين ، و dimerase فقط
نشاط.شين وآخرون.اقترح أيضًا أن فقط ثنائى PLA2 من سم الأفعى هو الشكل النشط للإنزيم.تثبت دراسة التركيب المكاني أيضًا أن PLA2 للأفعى الجرسية الغربية ذات الظهر الماسي موجود في شكل ثنائى.مركب آكل
هناك نوعان مختلفان من PLA ^ Ei و E2 من سم الأفعى ، حيث يوجد 仏 في شكل ثنائي ، ويكون الثنائى نشطًا ، ويكون المونومر المنفصل غير نشط.لو ينغهوا وآخرون.(1980) درس كذلك الخصائص الفيزيائية والكيميائية وحركية التفاعل لـ E. Jayanthi et al.(1989) عزل PLA2 الأساسي (VRVPL-V) من سم الأفعى.الوزن الجزيئي للمونومر PLA2 هو 10000 ، والذي له تأثيرات مميتة ومضادة للتخثر ووذمة.يمكن للإنزيم بلمرة البوليمرات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة بشرط PH 4.8 ، وتزداد درجة البلمرة والوزن الجزيئي للبوليمرات مع زيادة درجة الحرارة.الوزن الجزيئي للبوليمر الناتج عند 96 درجة مئوية هو 53100 ، ويزيد نشاط PLA2 لهذا البوليمر بمقدار 2
الوقت ما بعد: 18 نوفمبر - 2022